Криоконсервация

Уже в течение многих лет существует техническая возможность замораживать клетки различных видов, чтобы затем размораживать их спустя месяцы и годы без нанесения им значительных повреждений.

Проблема консервации в замороженном состоянии заключается в разрушении клеточных органелл, необходимых для дальнейшего развития. В основном это происходит из-за образования льда во время заморозки, потому что клетки по большей части состоят из воды. Следующий вид разрушения обусловлен потоком жидкости, вызванным осмотическим градиентом внутри клетки. Применение веществ, препятствующих замерзанию (антифризов) сокращает опасность повреждений, которая, тем не менее, все равно сохраняется.

Существуют два метода криоконсервации:

• так называемое slow-cooling, медленное охлаждение, называемом также slow-freezing
• rapid freezing, витрификация

При использовании метода “slow-freezing”, до сих пор чаще всего применяемого во всем мире, клетки под управлением компьютера постепенно охлаждаются до температуры в 196°C с применением антифризов, препятствующих образованию кристаллов льда в клетках, вследствие чего, благодаря остановке биологических процессов в клетке, возможно долговременное хранение. Добавленные криопротекторы (антифризы) максимально препятствуют осмотическим повреждениям клетки, однако, несмотря на малую концентрацию, они оказывают некоторый цитотоксический эффект (ядовиты для клеток). Кроме того они, в конечном счете, ненадежно препятствуют образованию льда, которое может повредить клеточные органеллы.

Данный метод, конечно, относительно прост с технической точки зрения и может производиться одновременно на нескольких клетках, но он имеет 30%-й риск возможных потерь. Это значит, что 1/3 клеток после размораживания не сможет завершить процесс оплодотворения и стать эмбрионами.

Даже перенос морфологически качественных эмбрионов не приводит к такой же высокой частоте наступления беременности, как при “свежем” цикле. Частота наступления беременности может быть на 30% ниже, чем при “свежем” цикле.
Метод slow freezing имеет смысл практически только для оплодотворенных яйцеклеток, на стадии так называемого пронуклеуса, поскольку они, по сравнению с неоплодотворенными яйцеклетками и эмбрионами, значительно менее чувствительны.

При проведении обычного ЭКО (при необходимости, включая ИКСИ) часто производится и отсасывается больше яйцеклеток, чем необходимо для достижения беременности в “свежем” цикле. Незадолго до завершения оплодотворения в результате слияния наследственного материала яйцеклетки и сперматозоида клетки находятся на так называемой PN-стадии (Pro Nucleus = пронуклеус). Только на этой стадии клетки можно заморозить с малым риском потерь.

Позднее они могут быть разморожены / культивированы в эмбрионы и перенесены в матку без повторного проведения перед этим гормональной терапии и операции по забору яйцеклеток.
Если перенос эмбрионов в “свежем” цикле был успешным, то эти клетки можно использовать, например, спустя два года, при проведении процедуры по зачатию следующего ребенка. Хранение без дополнительных  потерь качества может осуществляться в течение нескольких лет.
С помощью метода slow freezing, который в Германии наиболее часто используют для замораживания, практически невозможно без повреждения заморозить неоплодотворенные яйцеклетки (напр., в качестве репродуктивного резерва перед лечением рака, или для поддержания распространенного образа жизни “life-style”). Также и для эмбрионов данный метод не является оптимальным.

Витрификация (“ультрабыстрое замораживание”)
В течение последних примерно десяти лет в медицине все чаще применяется витрификация. Она представляет собой ультрабыстрый метод замораживания.

Витрификация – это способ, при котором посредством добавления определенных растворов из клеток удаляют внутриклеточную воду. Таким образом предотвращается образование кристаллов льда, повреждающих клетку. Можно практически не бояться механических повреждений компонентов клетки.
Однако, в связи с относительно высокой концентрацией криопротекторов (антифризов) принципиально имеется риск цитотоксического воздействия.

Большим преимуществом метода является высокая выживаемость при оттаивании, составляющая до 98%, и то обстоятельство, что наряду с оплодотворенными яйцеклетками витрификация позволяет также практически без риска криоконсервировать неоплодотворенные яйцеклетки и эмбрионы.

Огромное преимущество витрификации также заключается и в том, что она позволяет консервировать неоплодотворенные яйцеклетки для создания репродуктивного резерва в случае угрожающей репродуктивной способности химио- или лучевой терапии (Репродуктивный резерв). Таким образом могут обрабатываться также и яйцеклетки женщин (от 25 до 35 лет), которые хотят с целью увеличения шансов забеременеть в более поздний период жизни (40-45(?) сформировать репродуктивный резерв (так называемое социальное криоконсервирование).

Заморозка эмбрионов применяется, в частности, в странах, где разрешена селекция эмбрионов, когда на пятый день культуры на стадии бластоцисты имеется больше эмбрионов, чем нужно для переноса в матку.
Недостатком метода для практикующей его лаборатории является то, что возможна витрификация только отдельных клеток (а не группы яйцеклеток). Кроме того, применение данного метода требует более длительного накопления опыта и значительно более тонкого чутья, чем при медленном замораживании.

Крио-цикл

При так называемом крио-цикле в зависимости от возможных «гинекологических обстоятельств» в полость матки в естественном цикле или при гормональной стимуляции переносят эмбрион, который хранился замороженным на стадии яйцеклетки, оплодотворенной яйцеклетки или уже эмбриона. Затраты очень незначительны, т.к. пациентке в большинстве случаев нужно только один раз, примерно на 12-й день цикла пройти ультразвуковое исследование, чтобы установить оптимальный для переноса день. Если это оказывается необходимым, возможно проведение стимуляции кломифеном в таблетках (возможный недостаток: плоская слизистая матки) или инъекционной стимуляции. При этом речь идет не о росте яйцеклеток в результате стимуляции, а об образовании гормонов фолликулами.

Другую возможность создания крио-цикла представляет собой так называемый «искусственный цикл» или цикл ГЗТ (ГЗТ – гормональная заместительная терапия). При этом женщина вначале принимает исключительно эстрогены (перорально, вагинально или чрескожно), что вызывает рост слизистой матки. При наступлении оптимального момента времени дополнительно вводится прогестерон (гормон желтого тела (перорально или вагинально)). Преимущество такого подхода заключается в очень незначительной стоимости и отсутствии зависимости от состояния яичников. Недостаток заключается в том, что поскольку при этом ни фолликулы, ни желтое тело, соответственно, не берут на себя выработку гормонов, необходимо продолжать прием эстрогена и прогестерона примерно до 10-й недели беременности.

В зависимости от способа криоконсервирования и вида замороженной клетки может быть достигнута частота наступления беременности, соответствующая частоте при «свежем” цикле. Имеются современные научные наблюдения, которые демонстрируют, что шансы забеременеть при крио-цикле могут быть даже несколько выше, чем при свежем цикле. Это, однако, не относится к по-прежнему в основном проводимому slow freezing, а только к витрификации.